支原體感染的實驗室診斷主要是支原體的培養和血清學鑑定，目前主要採用基因診斷。
1.支原體培養：
a.採集標本，一般爲泌尿生殖試子或刷片，少數取前列腺液，精液、關節液，或取輸卵管，直腸活檢物，近年來用初段尿標本離心物，以取代尿道拭子。拭子取材時，將拭子插入男性尿道2-4cm，用力擦取。該方法容易造成尿道損傷及繼發感染。用時須慎重。女性則需先清潔宮頸鱗狀與柱狀上皮結合部，用細胞刷收集宮頸標本，能增加感染細胞的數量，較棉拭子敏感性高。
b.常用培養基爲牛心浸液或蛋白腖，並含1%新鮮酵母浸液，10-20%動物血清及0.5%氯化鈉，還可加葡萄糖和精氨酸以促進MH和MG生長，加入尿素以供UU代謝，適量加青黴素抑制雜菌。
2.血清學鑑定法：最常用的是瓊脂擴散法，即將支原體接種到瓊脂皿上。然後再用浸過適量血清的濾紙放到瓊脂表面，觀察哪一種能抑制支原體生長。也可用瓊脂表面的菌落作熒光抗體染色法，用落射熒光顯微鏡觀察，此法的優點是可以利用最初生長在瓊脂表面上的菌落而不必將支原體傳代。
血清學診斷試驗：酶聯免疫吸附試驗(ELISA)敏感性高：微量免疫熒光法(MIF)具有快速特點。
3.基因診斷：利用DNA探針對支原體診斷其敏感性稍差，但特異性高，用聚合酶鏈反應(PCR)，敏感性、特異性均高。具體檢測方面如下：
(1)標本處理
1.取材部位爲子宮頸管，男性爲尿道，將滅菌白金耳深入宮頸管或尿道1cm左右，轉動數圈，停留約30s，取出後置標本緩衝液中。
2.解脲脲原體DNA提取：
將宮頸管內或尿道內刮取物置含0.5%NP-40、0.5%Tween20，1%SDS和2mg/ml蛋白酶K的TES緩衝液(50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，100mmol/ L EDTA，pH 8.0)，置37℃裂解60 min，沸水5min，酚，氯仿抽提DNA乙醇沉澱，沉澱物溶於20μl TE緩衝液(100mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)。
(2)引物設計
引物來源於解脲脲原體，脲酶基因序列：
UU1：CAGATACATTAAACGAAGCAGG(1613-1635)
UU2：GTGGTGACATACCATTAAC(1837-1819)
(3)PCR擴增
傳統的方法爲的反應體積爲100μl，含5x反應緩衝液20μl和FD-DNA聚合酶2μ、4種dNTP各200μmol/L以及引物對各25pmol/L。上述成分預先一次性分裝於0.5ml離心管，-20℃備用。臨用加模板DNA 2μl，短暫離心，加100μl礦物油覆蓋。現在試劑已商品化，反應體積爲25μl，單管已分裝好，只要加入模板DNA即可。置DNA擴增儀進行40次循環擴增。每次循環包括90℃變性45s(第一次循環變性2min)，55℃退火30s和72℃延伸40s(最後一次循環72℃，延伸5min)三個步驟。每次擴增均應作陰陽性對照。
(4)擴增產物的檢測
1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測：取10u l PCR擴增物作1.5%瓊脂糖凝膠電泳、0.5μg/ml溴化乙錠染色，以PGEM-3Zf(+)DNA-Hae Ⅲ爲分子量標準，置紫外透射儀觀察結果。
