尖銳溼疣五大檢查手段

一、醋酸白試驗

用3-5%醋酸外塗疣體2-5分鐘，病竈部位變白稍隆起，肛門病損可能需要15分鐘。本試驗的原理是蛋白質與酸凝固變白的結果，HPV感染細胞產生的角蛋白與正常的未感染上皮細胞產生的不同，只有前者才能被醋酸脫色。醋酸白試驗檢測HPV的敏感性很高，它比常規檢測觀察組織學變化還好。但偶爾在上皮增厚或外傷擦破病例中出現假陽性、假陽性變白跡象顯得界限不清和不規則。美國CDC提示，醋酸白試驗並不是特異試驗，且假陽性較常見。

二、免疫組織學檢查

常用過氧化物酶抗過氧化物酶方法(即PAP)，顯示溼疣內的病毒蛋白，以證明疣損害中有病毒抗原。HPV蛋白陽性時，尖銳溼疣的淺表上皮細胞內可出現淡紅色的弱陽性反應。

三、組織化學檢查

取少量病損組織製成塗片，用特異抗人類乳頭瘤病毒的抗體作染色。如病損中有病毒抗原，則抗原抗體結合。在過氧化物酶抗過氧化物酶(PAP)方法中，核可被染成紅色。此法特異性強且較迅速，對診斷有幫助。

四、病理檢查

主要爲角化不全，棘層高度肥厚，乳頭瘤樣增生，表皮突增厚，延長，其增生程度可似假性上皮瘤樣。刺細胞和基底細胞並有相當數量的核分裂、頗似癌變。但細胞排列規則，且增生上皮和真皮之間界限清楚。其特點爲粒層和刺層上部細胞有明顯的空泡形成。此種空泡細胞較正常大，胞漿着色淡、中央有大而圓，深嗜鹼性的核。通常真皮水腫、毛細血管擴張以及周圍較緻密的慢性炎性浸潤。Bushke-loewenstein巨大型尖銳溼疣，表皮極度向下生長，代替了其下面的組織、易與鱗狀細胞相混，故須多次活檢。若有緩慢發展之傾向， 則爲一種低度惡變的過程，即所謂疣狀癌。

五、基因診斷

迄今，HPV難於用傳統的病毒培養及血清學技術檢測，主要實驗診斷技術是核酸雜交。近年來發展的PCR方法具有特異、敏感、簡便、快速等優點，爲HPV檢測開闢了新途徑。

(一)標本的採集及處理

1.標本的採集和預處理：用刮板或生理鹽水浸潤的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細胞。在作細胞學檢查的同時，將標本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS離心(3000g，10min)洗滌2次，沉積細胞重懸於1mlPBS中，取0。5ml細胞懸液抽提DNA。

2.標本核酸的提取：按1體積細胞懸液加10倍體積的細胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K)37℃下處理過夜;且等體積酚/氯仿(1：1)，氯仿/異戊醇(24：1)各抽提2次;加1/10體積3mol/L NaAc(pH 5.2)及2.5倍體積無水乙醇置-20℃ 2h或過夜沉澱DNA;加1體積乙醇洗滌1次;用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1.0mmol/L EDTA)溶解DNA，37℃溫育30min。

(二)PCR擴增

1. 引物設計和合成：HPV基因組可分爲早期區(E)和晚期區(L)，每區含一系列開放讀碼框架(ORF)。序列分析表明，各型HPV的非編碼區及E1、E6、E7和L1區均有保守序列。Manos等從HPVL1區中選擇保守序列設計合成引物MY11和MY09見表1，該引物與HPV 6、11、16、18及33型有互補序列，也可擴增其它型HPV。

反應試劑：Taq DNA聚合酶(2U/ml)、10mmol/L dNTP貯備液(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L)，10×PCR緩衝液(500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5)，100μmol/L MY11和MY09貯備液，滅菌的玻璃蒸餾器製備的蒸餾水。

擴增方法和程序：以100μl PCR反應液，用無菌0。5ml硅化塑料離心管爲反應管進行擴增反應。

(1)實驗前配製預混反應試劑並分裝。預混反應試劑包括除標本DNA外的其它各種PCR反應試劑。

(2)各反應管依次加入10μl標本和90μl預混反應試劑。

(3)加入80-100μl石蠟油，在臺式離心機上快速離心數秒鐘，使各反應試劑收集於油層下。目前，PCR試劑已商品化，反應體積爲25μl。使用時只加入標本DNA即可。

(4)將反應管置PCR擴增儀上，循環參數爲95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 50s循環35次，最後72℃延伸5min。

4.每次試驗應設陽性及陰性對照。以載有HPV的重組質粒(每反應爲100pg)或含有HPV的細胞系(如Caski、HeLa)DNA爲陽性對照，以無HPV的人細胞系DNA爲陰性對照。

(三)擴增產物的檢測和分析

1. 凝膠電泳：擴增反應結束後，取出反應管，冷卻至室溫，取10μl擴增產物用5%-7%聚丙烯酰胺凝膠或1.5%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀下分析結果，分子量約爲450bp處出現明顯的DNA帶。

2. 核酸雜交：如果凝膠電泳無清楚的DNA或需確定DNA帶的特異性時，可用標記的公用混合探針和(或)型特異探針作Southern吸印雜交、斑點雜交驗證。

按照標準方法制32P ATP標記的寡核苷酸探針，需達到約107cpm/pmol特異活性。雜交液中需含有2×106-5×106cpm探針/ml。在55℃緩慢振盪下雜交2-3h，隨後於30-55℃下用洗滌液(2×SSC、0.1%SDS)迅速沖洗雜交膜，除去多餘探針。然後進行洗膜，其條件依所用探針而異：公用混合探針，55℃洗膜10min;MY12、MY13及MY16探針，56-57℃下10 min，並換液重洗1次;MY14及WD74探針，58-59℃下10min，亦換液重洗1次。

用PCR方法檢測HPV比核酸雜交方法優越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝膠電泳直接分析結果，可檢出標本中200個拷貝的HPV DNA，若以核酸雜交檢測PCR產物，敏感性提高，能檢出10個拷貝的HPV DNA。

鑑於PCR技術的高度敏感性，以生殖道脫落細胞爲檢材足以滿足試驗要求，避免了活檢取材、研磨組織繁雜操作。一般情況下，PCR擴增產物經凝膠電泳，觀察產生的DNA可直接作出診斷。因此，PCR技術檢測HPV實驗週期短、簡便快速。